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雌激素受体α (Estrogen receptor α, ERα)是一种类固醇核受体, 在机体的多种生理功能中起关键作用。为了筛选新的ERα调节剂, 本研究建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因技术的高通量ERα调节剂筛选模型。利用RT-PCR技术从脂肪组织总RNA中扩增ERα配体结合区(Ligand binding domain, ERα LBD)基因序列, 并插入含GAL4 DNA 结合域的pBIND-GAL4表达质粒构建pBIND-GAL4-ERα(LBD)的嵌合表达质粒。该质粒与本室已构建好的含GAL4响应元件和荧光素酶的报告质粒pGL3-GAL4共转染, 通过测定荧光素酶的活性评价ER调节剂的转录调剂的活性。经过多种条件优化, 激动剂阳性药对照雌二醇可以剂量依赖地诱导荧光素酶的表达, 最大上调倍增数可达28.1倍, EC50为0.17 mmol/L。拮抗剂阳性对照它莫昔芬可以有效地拮抗雌二醇的活性, 最大下调倍数为6.3倍, EC50为0.1 mmol/L。该筛选模型可微量化于384孔板, 且Z'因子均大于0.5。利用该模型从2000多个微生物和植物来源的天然产物以及合成化合物中筛选得到4个ERα激动剂。该模型灵敏、稳定, 可以快速进行多种来源的ERα调节剂的筛选和活性评价。

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《基于哺乳动物单杂交技术ERα调节剂高通量筛选模型的建立及应用》

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文件号：090868

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