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运用定向进化-易错PCR的方法, 提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选, 从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28, 脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明, 突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变: A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示, 突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上, 靠近脂肪酶底物结合区域, 与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引, 使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明, 突变株2-28脂肪酶的Km值比发菌株下降了10%, Kcat值提高为原来的2.75倍。

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《定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力》

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文件号：091266

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